中国茶叶生物化学研究40年（二）
2019-11-22 作者: admin 来源: 未知 已阅读次
3. 儿茶素的生物合成
儿茶素类化合物（Catechins）是2-苯基苯并吡喃的衍生物，属于类黄酮化合物（Flavonoids）中的黄烷-3-醇类（Flavan-3-ols）。类黄酮分子中的A环是由3 个乙酸分子头尾相接而成的，而B环与C环上的碳原子则来自于由莽草酸途径合成的苯丙氨酸。苯丙氨酸经过苯丙酸盐途径形成查尔酮后，再进入各种不同的类黄酮合成途径，形成不同的黄酮类物质。这些黄酮类物质的生物合成途径具有部分的同源性。
茶树中主要多酚类物质——儿茶素类合成是一个复杂的网络途径，涉及莽草酸途径、苯丙烷类代谢途径和类黄酮合成途径，并形成多种产物（图2）。叶片中的儿茶素类化合物特别是酯型儿茶素含量远远高于根中，但后者的原花青素（聚合的儿茶素） 含量是叶片的数倍，说明叶中的儿茶素类化合物后期的合成是以没食子酰基化反应为主，而根中是以原花青素聚合反应为主。
植物体中类黄酮化合物的B 环羟基数目受黄酮-3'- 羟化酶（F3'H）和黄酮-3',5'- 羟化酶（F3'5'H）基因的调控，顺式和反式儿茶素含量受花色素还原酶（ANR）和无色花色素还原酶（LAR）基因的控制，但是酯型儿茶素的没食子酰基化机理尚不完全清楚。Niemetz 等系统研究了水解单宁合成的相关酶类，推测1-O-没食子酰-β-葡萄糖（βG）是单宁合成有效的酰基供体和受体。利用体外酶学手段，揭示了反式儿茶素C 和GC的合成模式，发现在DFR和LAR催化下，二氢黄酮醇形成无色花青素即花白素，然后形成反式儿茶素C和GC。儿茶素的合成过程中，花青素合成酶（CsANS）是一个重要的关键酶。前期研究发现光照是CsANS基因编码的一个重要调节因素。
Liu等研究发现1-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖转移酶（UGGT）和O-没食子酰基转移酶（ECGT）是酯型儿茶素合成过程两个关键酶。这两个酶分别以尿苷二磷酸葡萄糖和1-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖为底物。没食子酰基化过程与水解单宁合成途径具有相似性，即βG是它们合成的酰基供体。
茶树中的黄酮醇类物质占干重的3%～4%，多以糖苷形式存在，在茶提取液的纸层析谱上就能鉴别出20多种，大部分是上述3种基本黄酮醇的各种糖苷。黄酮与黄酮醇的差别只是少1个3-羟基取代，在植物中它大多以黄酮糖苷的形式存在。
Liu等利用分析化学和转录组学的手段研究春季和秋季茶树儿茶素生物合成的差异。秋茶中总儿茶素的含量显著高于春茶，其中以EGC最为突出。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、黄酮-3-羟化酶（F3H）、黄酮-3',5'-羟化酶（F3'5'H）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和花青素合成酶（ANS）的基因表达与儿茶素的含量密切相关。Zhang等也研究了黄酮代谢通路中相关基因表达与儿茶素含量的关系，结果发现查尔酮合酶1、查尔酮合酶3、花青素还原酶1、花青素还原酶2 和无色花青素还原酶（LAR）的表达与儿茶素含量呈正相关，其中花青素还原酶（ANR） 和无色花青素还原酶的表达与酯型儿茶素（EGCG、ECG）含量呈正相关。
近期有研究报道茶树叶片的不同位置会影响其光合作用和呼吸。叶片的成熟过程中，呼吸速率以及总氮含量会持续下降，但是淀粉的含量却会随着成熟度的增加而增加。成熟叶片中叶绿素a 和b 的含量都显著增加，另外，氨基酸和茶多酚的含量显著降低。还有一些学者通过基因共表达网络的分析来探讨茶树3 种特征性成分的相互调节关系，通过研究发现3 类次生代谢产物的相关基因相互影响，并且相关性分析发现F3'5'H、FLS和βG不仅与EGCG的代谢相关，还与咖啡碱代谢相关。Jin 等最近从贵州野生茶树中发现了F3'5'H 突变等位基因，其丢失了14个碱基对，从而导致F3'5'HmRNA 表达水平很低，使得野生茶树中三羟基儿茶素含量较低。Tai等人还比较了茶树和油茶（Camellia oleifera）在转录组水平的差异。
Yang等还研究了不同氮形态对于茶叶中主要次生代谢产物合成的影响，结果发现施铵态氮对于茶树次生代谢产物差异基因表达的影响大于施硝态氮或者同时施铵态氮和硝态氮。长时间给予硝态氮会减少黄酮类的生物合成，但是会增强咖啡碱和茶氨酸的生物合成。Fan 等也比较了铵态氮和硝态氮两种氮肥对茶树次生代谢的影响，发现Cs-miR156是调节儿茶素次生代谢途径中关键基因的一个调节基因。硝态氮会增加芽头中儿茶素的含量， 并且PAL、CHS、CHI和DFR的相关基因也呈现出高表达，Cs-miR156 的高表达则受到铵态氮的影响。Sun等也试图通过生物信息学的手段挖掘与儿茶素合成基因相关的miRNAs，研究结果发现miR529d 和miR156g-3p 分别是CHI 和F3H两种基因表达的负调控因子。
Chen等还专门研究了茶树与儿茶素异构化相关基因的表达。特殊茶树品种Y510 含有较高含量的GCG和C，但是其EGC和EC含量却很低。RNA序列分析发现两个影响儿茶素异构化的关键基因，花青素还原酶基因（CsANR1、CsANR2）和花青素合成酶基因。CsANS在拟南芥突变体tds4-2 的过表达会导致EC含量显著增加。Li等也通过比较Camellia ptilophylla 和Camellia sinensis儿茶素合成相关基因转录水平的差异，发现Camellia ptilophyllaa的CpANS2与Camellia sinensis相似度仅有80%左右，推测其可能失去了合成cis-儿茶素的能力，从而导致白毛茶中表型儿茶素含量较低。
甲基化儿茶素是另一类具有显著生理活性的儿茶素衍生物。一般认为，甲基化儿茶素也是通过黄酮类途径合成，咖啡酰基-CoA-3-O-甲基转移酶是与甲基化儿茶素生物合成的关键酶。研究发现CsWRKY31和CsWRKY48转录因子与甲基化儿茶素的合成有关，这两个转录因子的表达会抑制CsLAR、CsDFR、CCoAOMT基因的表达。此外，Zhang等人也发现ANL2、WRKY44 和AtMYB113等转录因子也与儿茶素的合成相关。
1. 萎凋
陈静等研究了白茶萎凋过程中茶多酚和儿茶素组分含量的变化，以及这些变化与其合成途径中关键酶基因表达的变化情况。结果发现萎凋32 h 后，非酯型儿茶素EC、GC、EGC 和酯型儿茶素ECG和EGCG的含量达到最高值，且这种含量变化与儿茶素合成途径中关键酶PAL、C4H、F3H、F3'H、DFR、LAR、ANR 基因的表达基本一致。因此提出在白茶萎凋中，适当缩短萎凋时间，可以提高白茶品质。
刘亚峰等利用通径分析研究了萎凋槽和萎凋室中不同萎凋程度对红茶化学成分与感官品质之间的关系。在以空调和除湿机控温控湿的萎凋室中，萎凋至水分含量58%～60%之间时，红茶品质最好。茶多酚、游离氨基酸、茶黄素双没食子酸酯（TFDG）、EC、EGCG和ECG与感官品质呈负相关，而茶黄素（TF1）、茶黄素-3-单没食子酸酯（TF-3-G）和茶黄素-3'- 单没食子酸酯（TF-3'-G）与感官品质呈正相关，且TF-3'-G 是影响红茶品质的最主要成分。
庞月兰等研究了萎凋程度对红条茶品质的影响，设置了56.00%～59.99%、60.00%～63.99%和64.00%～68.00% 3 个萎凋程度处理，发现凌云白毫茶红条茶萎凋时间为17 h，萎凋叶含水量至60.00%～63.99%时，成品茶香气浓郁，汤色红亮，滋味浓厚，叶底红亮，茶黄素和茶红素含量均较高。
2. 杀青
吴本刚等以镇江金山翠芽茶鲜叶为原料，以蒸汽杀青为对照，研究了红外杀青对茶叶品质和理化成分的影响，确立了最优的杀青干燥工艺条件为：红外辐照距离20 cm 杀青150 s，经揉捻做形后，热风干燥温度70℃、干燥40 min，制成品中维生素C和茶多酚保留量较高，外形色泽紧实翠绿，茶香明显。同时建立了红外杀青过程中PPO 钝化动力学模型和干燥过程中水分干燥动力学模型，可为杀青干燥过程预测提供理论参考。吴雅丽综述了杀青技术对改善夏秋茶品质的研究进展，指出蒸汽杀青有利于茶多酚物质和蛋白质的水解，氨基酸含量增加，有利于减少夏秋茶品质的苦涩味。
3. 发酵
发酵是红茶加工中的关键过程，也是形成红茶特有品质的关键工序。Tan 等对工夫红茶发酵过程中（0～14 h，2 h 间隔取样） 的非挥发性成分进行代谢组分分析表明，儿茶素、儿茶素二聚体、黄酮醇糖苷、氨基酸、酚酸、生物碱和核苷酸等成分发生了显著变化；随着发酵时间的延长，儿茶素类、香豆素、原花青素B1和B2 显著下降，咖啡碱较稳定，茶氨酸略降，而茶氨酸葡萄糖苷、杨梅素C糖苷、腺苷酸、香豆酰奎宁酸显著上升。
4. 干燥
郭桂义等以低档信阳毛尖毛茶为原料，研究了不同烘焙温度和时间对品质的影响。研究发现烘焙能够去除茶叶粗老气和青草气，有利于提高茶叶香气，降低茶汤苦涩味，在100℃下烘焙15 min或30 min信阳毛尖茶的品质最优，茶叶中的氨基酸、咖啡碱等物质含量较高。
陈义等以不同嫩度的信阳夏茶红茶为原料，研究了50℃的炭火温度下，不同烘焙时间对茶叶感官品质的影响。研究发现炭火低温长焙能够改变信阳夏茶红茶的感官品质，提高茶叶香气，且水浸出物、茶多酚和咖啡碱含量均有不同程度的降低，从而降低了茶叶的涩味。其中一芽一叶和一芽二叶原料茶分别慢焙10.5 h，品质最佳；而一芽二三叶原料茶叶则慢焙14 h品质最佳。
张丽等以水仙、肉桂2 个品种的武夷岩茶毛茶为原料，经不同程度（130℃～150℃，2～4 h） 焙火处理后。结果表明，随着焙火程度的增加，醇类含量呈降低趋势，酯类和酮类含量呈增加趋势，其中具花果香的脱氢芳樟醇、己酸叶醇酯、己酸己酯等主要香气物质含量呈先增后减的变化趋势， 具烘烤香或焦糖香的香气物质（如1- 乙基-1H-吡咯） 呈增加趋势，苯乙腈、2，5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪和2-乙酰基呋喃等整体呈先增后减的变化趋势。
茶叶生物化学的基础研究为茶叶的品种选育、加工提升以及精深产品延伸提供了坚实的理论依据。然而，尽管近年来茶学研究的最新科技进展不断涌现，但是也存在一些研究内容雷同、研究方式类似的问题，尤其是近年来茶叶生物化学研究过程中积累的大量研究数据缺乏有效的沟通与共享。
以茶叶加工化学的研究为例，加工过程中茶叶中主要物质的变化规律受到许多因素的影响，例如基础材料（鲜叶） 的成分差异，成分之间的相互作用，加工条件和参数等因素的影响，这类加工化学的研究往往都具有一定的个体性，而难以代表不同茶类，甚至同类茶叶的规律。因此，以茶叶主要内含物质为基础，建立标准化的组合化学物，并以其为基础模拟茶叶加工过程中热、湿度、pH值、酶促反应、单一/组合微生物发酵等条件，探究茶叶成分的变化规律，相互作用特点，建立可重复、可参考的茶叶化学转化模式，从而揭示茶叶加工过程中的生化变化特点。此外，国内多个科研院所都分别建立了茶叶相关数据，涵盖了茶叶研究的各个方面，存在着一定的重复建设和资源浪费。因此，亟待建立区域间协作，甚至是国际范围内的茶叶生物（基因） 和化学数据库，供全球茶叶研究者和公众使用。
责任编辑：千鹤茶苗